Métodos
Conhecendo as técnicas
sistema de varredura, também conhecido como “scan-head” ou “scanner”, faz a varredura do feixe da amostra e também coleta o sinal para a imagem do sinal coletado pela objetiva. O “pinhole” é um dos principais componentes do scan head, que atua como um filtro espacial conjugado com o plano focal da objetiva posicionado diretamente em frente às fotomultiplicadoras.
As imagens são adquiridas em 2D fazendo uma varredura no plano focal. As varreduras em X e Y são feitas por dois espelhos independentes. Quando o espelho responsável pela direção X termina de varrer uma linha, ele volta à posição inicial enquanto o espelho responsável pela varredura em Y muda para uma nova posição. A fluorescência que é gerada em cada ponto é coletada pela objetiva retornando pelo mesmo caminho, passando pelos espelhos de varredura no sentido inverso, esse processo é conhecido como “descanning” do sinal. Após os espelhos de varredura a fluorescência passa direto pelo espelho dicróico e é focalizado no pinhole.
Enquanto o laser varre a amostra, o sinal de cada ponto é detectado pelo detector, que está conectada ao computador. Esse sinal é convertido em uma imagem digital onde cada pixel representa um ponto varrido na amostra. A intensidade do pixel será proporcional a intensidade do sinal detectado. A reconstrução de imagem 3D é feita sobrepondo as imagens em 2D para diferentes planos focais no eixo Z.
Para que o sistema de varredura funcione corretamente é adotada uma montagem, que fica interna ao microscópio, composto por duas lentes que formam um telescópio. Esse telescópio tem como objetivo fazer com que o feixe do laser entre inclinado na objetiva sem diminuir a intensidade e seu funcionamento é descrito na figura abaixo.
Os espelhos galvanômetros são colocados no foco da lente de entrada, essa lente está com o foco no mesmo local do foco de uma segunda lente que direciona o feixe para a entrada da objetiva, assim o sistema de varredura inclina o feixe na objetiva (a), um feixe entrando inclinado na objetiva irá focalizar no mesmo plano de um feixe perpendicular tento um deslocamento proporcional a inclinação (b).
Referências
- https://www.edmundoptics.com/knowledge-center/application-notes/microscopy/confocal-microscopy/
- PELEGATI, Vitor Bianchin. Microscopias de óptica não linear: fluorescência excitada por absorção de dois fótons, geração de segundo harmônico e geração de terceiro harmônico. 2010. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin, Campinas, SP.
O spinning disk é um equipamento que adquire imagens confocais utilizando um disco giratório (daí o nome spinning disk) com furos de 50 micrômetros que fazem a função do pinhole. A vantagem dessa abordagem é adquirir imagens bem mais rápidas do que a técnica de varredura a laser. Para isso é necessária uma câmera de alta velocidade.
A Yokogawa, do Japão, é a líder em equipamentos spinning disk. Esses scanners são equipados com uma arquitetura única que consiste em dois discos alinhados coaxialmente, apresentando um espelho dicróico posicionado entre os discos. Cada disco contém aproximadamente 20.000 orifícios com espaçamento de 250 micrômetros dispostos em uma série de espirais aninhadas. O disco superior é uma placa de vidro contendo microlentes de Fresnel em sua superfície superior, que direcionam e focalizam a luz nos pinholes perfeitamente alinhados de localizados no disco inferior.
O feixe de laser entra no scanner por uma fibra óptica e passa por uma lente especial para ajustar a distribuição de intensidade do feixe e, em seguida, é projetada sobre o disco de microlentes. Os discos são girados mecanicamente e realizam uma varredura raster muito rápida do campo de visão. A varre
dura multifeixe com o CSU-X1 não apenas aumenta a velocidade de varredura, mas também resulta em fotobleaching e fototoxicidade significativamente menores, pois a excitação múltipla requer apenas um baixo nível de potência do laser na amostra para excitar completamente a fluorescência.
Referências:
A Geração de Terceiro Harmônico (THG) é um processo de óptica não linear de terceira ordem, o que significa que três fótons de frequência fundamental ω são aniquilados simultaneamente, resultando na criação de um fóton com o triplo da frequência 3 ω (e, consequentemente, um terço do comprimento de onda original). Este fenômeno é regido pela susceptibilidade não linear de terceira ordem χ(3) e ocorre em qualquer meio material, diferentemente da Geração de Segundo Harmônico (SHG), que requer a ausência de simetria de inversão.
As setas possuem comprimento proporcional à energia ℏω dos fótons (inversamente proporcional ao comprimento de onda) as linhas contínuas representam níveis de energia reais e as linhas tracejadas representam níveis de energia virtuais. A) Fluorescência excitada por absorção de dois fótons TPEF. B) Geração de segundo harmônico SHG. C) Geração de terceiro harmônico THG.
Cálculos matemáticos mostram de que a geração de terceiro harmônico no limite de um feixe fortemente focalizado desaparece para a condição de perfeito phase-matching 
e é maximizado através de 
positivo. Esse comportamento pode ser entendido em termos da mudança de fase de π radianos que ocorre no foco de qualquer feixe focalizado.
Esta anomalia de fase, que leva o nome de mudança de fase de Gouy (1890), tem consequências importantes para a óptica não linear, porque em geral, a polarização 
experimenta uma mudança de fase que é q vezes maior do que a experimentada pelo feixe incidente. Consequentemente a polarização não linear não acoplará corretamente com o feixe incidente ao menos que haja uma incompatibilidade dos vetores de onda , que compensará a mudança de fase devido à passagem do feixe pelo foco.
Esse resultado tem grande importância para a microscopia THG, e implica que o mesmo não pode ser obtido de uma estrutura com grande volume. Resultado que foi primeiro demonstrado por Boyd e precedeu a primeira microscopia por geração de terceiro harmônico realizada por Silberberg.
O sinal de terceiro harmônico gerado por um meio com grande volume é cancelado devido a interferência destrutiva associada a mudança de fase, mudança de fase de Gouy, que um feixe de excitação sofre ao passar pelo foco. A contribuição do THG gerada antes do foco é cancelada (interferência destrutiva) pelo THG gerada após o foco (na mesma magnitude, mas com fase oposta), resultando em uma intensidade de THG quase nula ou extremamente baixa na saída.
O sinal de THG torna-se significativamente forte apenas em interfaces ou em regiões com heterogeneidades ópticas (como variações no índice de refração ou na susceptibilidade χ(3)). Nesses pontos, o equilíbrio de simetria da integração de fase ao redor do foco é quebrado, e o sinal gerado em ou próximo à interface não é totalmente cancelado.
Com esse resultado chegamos à conclusão de que para uma interface entre dois meios não dispersivos, o sinal será proporcional à distância entre a interface de dois meios e a diferença entre os valores de χ(3) desses meios. Em amostras biológicas, que são em sua maioria compostas por água, uma grande fonte de THG são os lipídios.
Imagem de amostra de mama marcada com HE, em verde TPEF, em vermelho SHG e em magenta THG, com objetiva de 10x
Referências:
- Boyd, Nonlinear Optics (Academic, New York, 1992)
- Barad, H. Eisenberg, M. Horowitz, and Y. Silberberg, ‘‘Nonlinear scanning laser microscopy by third-harmonic generation,’’ Appl. Phys. Lett. 70, 922–924 (1997).
- Débarre and E. Beaurepaire, ‘‘Quantitative Characterization of Biological Liquids for Third-Harmonic Generation Microscopy,’’ Biophys J. 92(2): 603–612 (2007).
- PELEGATI, Vitor Bianchin. Microscopias de óptica não linear: fluorescência excitada por absorção de dois fótons, geração de segundo harmônico e geração de terceiro harmônico. 2010. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin, Campinas, SP.
Equipamentos utilizados: Laser pulsado Chameleon Discovery NX da Coherent e Microscópio Zeiss LSM 780 Invertido ou Upright.
Uma forma de representar os processos de óptica não linear é através de diagramas de níveis de energia. A figura abaixo mostra os fenômenos de óptica não linear realizados no nosso trabalho.
As setas possuem comprimento proporcional à energia ℏω dos fótons (inversamente proporcional ao comprimento de onda) as linhas contínuas representam níveis de energia reais e as linhas tracejadas representam níveis de energia virtuais. A) Fluorescência excitada por absorção de dois fótons TPEF. B) Geração de segundo harmônico SHG. C) Geração de terceiro harmônico THG.
A geração de harmônicos pode ser explicada classicamente através de um modelo de um oscilador não harmônico. Em um oscilador harmônico a força restauradora é linear com o deslocamento . Supondo uma força dissipativa proporcional à velocidade, a equação diferencial do oscilador harmônico amortecido não forçado é dada por: